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DRIP-seq

  • 简介
  • 服务优势
  • 实验流程
  • 结果展示

  • 背景介绍

    R -loop是由转录的RNA链与打开的双链DNA其中一条链发生碱基互补配对，形成RNA-DNA杂合链，同时与未配对的另一条DNA链游离在外组成的三方结构 [1]。它们分布广泛，占哺乳动物基因组的 5% [2,3]。 R-loop经常出现在基因组的启动子CGI和转录终止位点，形成R-loop的结构因素包括高度的GC偏倚（GC skew，在TSS下游的非模板链上，G比C富集）、G四联体、DNA缺口和DNA/RNA修饰等[4]。它们在调节基因表达、DNA 复制以及 DNA 和组蛋白修饰方面发挥着重要作用，具有重要的生物学功能。

    图1: R-loop的结构[5]


    DRIP-seq与Arraystar LncRNA芯片、MeDIP-seq或者CHIP-seq联合分析，可为揭示R-loop在表观遗传以及转录调控中的重要功能给予有价值的研究视角。


    R-loop顺利获得影响DNA甲基化调控mRNA转录

    有研究发现，在运动神经元疾病肌萎缩侧索硬化（ALS4）病人中，senataxin突变导致BAMBI（TGFβ的负调控因子）启动子R-loop含量降低，进而促进启动子DNA甲基化来抑制BAMBI转录，最终激活TGFβ信号通路，促进疾病发生开展[6]。


    图2: ALS4病人senataxin突变抑制R-loop形成进而抑制BAMBI转录



    Antisense LncRNAs形成R-loop影响mRNA转录

    TCF21是与一种抑癌基因，在多种癌症中表达下调，它具有头对头反义lncRNA TARID（TCF21 antisense RNA inducing demethylation）。TARID在TCF21启动子附近形成R-loop，被R-loop识别蛋白GADD45a结合，招募去甲基化酶TET1，促进DNA去甲基化来增强TCF21转录，影响细胞周期[7]。


    图3: Antisense lncRNA顺利获得形成R-loop调控TCF21启动子DNA去甲基化及转录[4]



    R-loop高通量筛选平台DRIP-seq

    对于R-loop的筛选通常采用DRIP-seq（DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing），该项目侧重于顺利获得NGS在基因组水平上检测R-loops结构的分布。并且顺利获得生物信息学分析，可以在不同的领域从中挖掘出更多有用的信息。

    DRIP-seq选择 S9.6 抗体来富集 R-loop，S9.6 抗体用于特异性免疫沉淀 DNA：片段化后的 RNA 杂交体。然后可以顺利获得对 R-loop的 DNA 链进行测序来实现 R-loop分析。


    参考文献：

    [1] S. Hamperl, K.A. Cimprich, The contribution of co-transcriptional RNA:DNA hybrid structures to DNA damage and genome instability, DNA Repair 19 (2014) 84–94.

    [2] L.A. Sanz, et al., Prevalent, dynamic, and conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals, Mol. Cell 63 (1) (2016) 167–178.

    [3] Li. Miaomiao, et al., Modifications and interactions at the R-loop, DNA Repair 96 (2020) 102958.

    [4] Christof Niehrs and Brian Luke, Regulatory R-loops as facilitators of gene expression and genome stability.Nat Rev Mol Cell Biol. 2020 Mar;21(3):167-178.

    [5] A.H. Youssef, et al., The balancing act of R-loop biology: The good, the bad, and the ugly, J. Biol. Chem. (2020) 295(4) 905–913.

    [6] Christopher Grunseich et al. Senataxin Mutation Reveals How R-Loops Promote Transcription by Blocking DNA Methylation at Gene Promoters Mol Cell. 2018 Feb 1;69(3):426-437.e7.

    [7] Khelifa Arab et al., GADD45A binds R-loops and recruits TET1 to CpG island promoters. Nat Genet. 2019 Feb;51(2):217-223.

  • 严格的质控体系：设置阴性对照组和阳参，以控制文库质量。

    稳定性高：实验操作稳定性高，减少实验操作带来的误差。

    灵活度高：能够直接对有基因组信息的物种进行R-loop测序。

    给予数据可视化，丰富的注释信息与文章发表级别的图谱



  • 1.  基因组DNA抽提

    2.  超声片段化DNA

    3.  S9.6抗体免疫共沉淀

    4.  R-loop洗脱与cDNA第二链合成

    5.  DRIP-seq文库构建

    6.  高通量测序

    7.  数据分析

    8.  给予实验报告


  • 1.R-loop peak注释表


    2. R-loop peak 在不同基因特征上的分布。

    图：饼图显示了R-loop peak在每个基因特征上的数目和比例。


    3. R-loop peak 在不同基因特征上的富集度


    图：R-loop peak在不同基因组特征上的数目富集度和长度富集度。红色柱子：peaks占总peaks数目的占比, 表示实际某基因特征的peak占比；蓝色柱子：基因组特征区长度占所有基因特征区长度总和的占比，这个柱子可以等同于随机分配情况下某基因特征内的peak占比。


     4.R-loop peak在Genebody上的分布


    图：R-loop peak在Genebody周围的分布。X轴表示到TSS或TES的距离，Y轴表示peak区的数目。